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Inserm Necker Hospital
- Master Immunotechnologie Stage
2011 - maintenant
Ciblage du processus d’hypermutation somatique au sein des gènes d’immunoglobuline. Techniques de clonage, transfection cellules ES, culture cellulaire ES et EF, Recombinaison homologue, Knock-in, Eléctrophorèse, PCR, q-PCR, Southernblotting, RA, Séquençage, Extraction de rate, protocole de marquage cellulaire, mise en place de protocole, Analyse de profil de mutation au sein des gènes d’Immunoglobuline, Construction vecteur, cytométrie de flux, manipulation modèle murin Delbos Frédéric, Pr. Reynaud Claude-Agnès, Pr. Weill Jean-Claude.
Le Laboratoire U783 Développement du système immunitaire étudie le rôle des ADN polymérases dans le processus de l'hypermutation somatique des gènes des immunoglobulines, responsable de la maturation de l'affinité des anticorps. La capacité de modification des gènes des immunoglobulines est restée pendant longtemps sans explication d’un point de vue moléculaire, jusqu’à la découverte d’une enzyme, l’AID (activation-induced cytidine desaminase). Cette enzyme a la propriété de désaminer les bases Cytidine de l’ADN en Uracile. L’inactivation de cette enzyme, empêche les mutations somatiques mais aussi la commutation isotypique au niveau des gènes des immunoglobulines. Mais l’AID n’est pas la seule enzyme qui va créer la mutagenèse des gènes des immunoglobulines car on observe également des mutations au niveau des bases autres que C et G. D’autres facteurs participants au processus d’hypermutation somatique ont été décrits tels que l’UNG (Uracile glycosylase), le mismatch repair (MSH2-MSH6) et l’ADN polymérase η. Le modèle du laboratoire serait le suivant : L’uracile produit par l’AID, est dans un premier temps reconnu comme un mésappariement G/U par le complexe du mismatch repair MSH2/MSH6 en phase G1. A son tour, le mismatch repair va recruter l’ADN polymérase η pour réparer la lésion G/U, en resynthétisant un petit segment d’ADN introduisant de nouvelles mutations au niveau des bases A/T (signature de l’enzyme) (F.Delbos et al. 2007), (JC. Weill et CA. Reynaud 2008). A la phase S du cycle cellulaire, l’UNG accède aux uraciles de l’ADN en cours de réplication et produit des sites abasiques (N). Ces sites abasiques sont répliqués par des polymérases translésionnelles (franchissent les lésions) qui incorporent n’importe quelle base ciblant les G/C. Il existe donc deux voies qui agissent en compétition pour créer des mutations au niveau des gènes V des Immunoglobulines : Voie médiée par AID-MSH2/6 pol η et Voie médiée par AID/UNG. Mon laboratoire d’accueil propose un modèle dans lequel, les deux voies de réparation via MSH2/MSH6 et via UNG fonctionneraient de façon compétitive, résultant en leur mobilisation spécifique à des phases distinctes du cycle cellulaire.
Le premier projet s’articule autour de la question du ciblage du processus d’hypermutation somatique au niveau du locus des Immunoglobulines. On s’intéresse à savoir quel est le brin ciblé par la polymérase η lorsqu’elle est recrutée par le complexe MSH2-MSH6 suite à la désamination des cytidines par l’AID. En effet, deux scénarios peuvent se produire : -Soit la polymérase η resynthétise une courte séquence d’acides nucléiques en introduisant des mutations en face des T et des A (préférentiellement un G en face d’un T introduit par la polymérase η et un A en face d’un A) à l’endroit de la lésion U («Uracil lesion») au niveau du brin non-codant. Et par conséquent, lors de la réplication on aura un profil de mutation particulier les T seront devenus des C et les A seront devenu des T. Soit la polymérase η
resynthétise une courte séquence en face de la lésion U («Translesional synthesis ») et par conséquent, suite à la réplication on aura un autre profil de mutation qui est le suivant : les A sont devenu des G et les T sont devenu des A. Ainsi, en utilisant la signature moléculaire de la polymérase η, il sera possible d’étudier le brin ciblé après l’analyse des profils de mutation.
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Faculté Pharmacie Timone ETRAV VIH
- Master Recherche Immunologie
2010 - 2010
Etude de la protéine Tat du HIV-1 comme agent immunogène dans une approche vaccinale. Proposition d’une méthode de détection de la protéine Tat du VIH-1 dans le sang des patients. Techniques : Westernblotting, Immunoprécipitation, Tests de transactivation (Cellules HeLa), Culture cellulaire, ELISA, Synthèse peptidique automatisée en phase solide, HPLC semi préparative et analytique.Pr. LORET Erwann, MEDIOUNI Sonia, BAILLAT Gilbert.
Etude de la protéine Tat du HIV dans une approche vaccinale. Identifié en mai 1983 à l’Institut Pasteur par le Professeur Luc Montagnier et ses collaborateurs, et par la suite aux USA par Max Robert Gallo, le VIH-1 est responsable du SIDA chez l’Homme. En 2008, on comptait 33.4M de patients atteints du HIV-1 et 1.9M de patients contaminés décédés par cette pathologie. Malgré d’intenses recherches, les thérapies actuelles visent seulement au ralentissement de la pathologie et non à son éradication. Leur système immunitaire est incapable d’éliminer les cellules infectées par le VIH-1, ceci serait en partie dû à une protéine codée par son génome, la protéine Tat . Cette protéine virale joue un rôle primordial dans l’immunodéficience et est impliquée dans les pathologies liées au SIDA, comme le sarcome de Kaposi et autres troubles physiologiques. Outre son rôle de transactivateur de la transcription du génome viral, la protéine Tat peut être sécrétée dans le compartiment extracellulaire, et pénétrer dans les cellules avoisinantes. Agissant ainsi comme une véritable toxine cellulaire, il est intéressant de cibler cette protéine Tat pour des approches vaccinales. Une Etude réalisée sur une cohorte gabonaise de patients ont montré résister au VIH-1 grâce à un variant Tat très immunogène nommé Oyi (défectueux dans son rôle d’activateur par la mutation C22 par une S22, conférant ainsi une immunité contre le virus aux patients. Les anticorps contre ce variant sont capables de reconnaître différents variants et de les neutraliser. Les anticorps neutralisants reconnaissent souvent un épitope 3D. Nous nous interrogerons sur la structure de la protéine Tat dans le sérum de patients afin de conclure sur le type d’anticorps nécessaire à l’éradication de la pathologie. Puis, dans un second temps, une quantification de la protéine Tat circulante dans le sérum des patients infectés et sous traitements thérapeutiques, démontrera l’intérêt d’une stratégie vaccinale anti-Tat.
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Laboratoire Ingénierie des peptides à visée thérapeutique
- Master Recherche Stagiaire
2010 - 2010
Synthèse, purification de peptides ayant un intérêt thérapeutique, études sur les allergènes. Techniques HPLC semi-préparative et analytique, spectrométrie de masse, purification, lyophilisation et synthèse peptidique automatisée en phase solide. (Marseille Hôpital Nord). Pr. Sabatier Jean-Marc, Ingénieur/Chercheur ANDREOTTI Nicolas, MOUHAT Ludovic.
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CNRS Instabilité du Génome et Cancérogénèse
- Master Recherche
2009 - 2010
Etude sur les modes d’action des CDK-cyclines, dommages à l’ADN, modèle levure, Techniques Westernblot, biochimiques, Adaptations de protocoles. Test de phosphorylation, Immunoprécipitations sur billes magnétiques, Electrophorèse. Croisements sur levures. Pr. Bailly Eric, V.Géli, Equipe Dr Fuchs.
De multiples changements génétiques se produisent durant l’évolution d’une cellule normale vers une cellule cancéreuse. La cellule va perdre les processus qui permettent la réplication fidèle des chromosomes, les processus de réparation de l’ADN, de la ségrégation correcte des chromosomes. Ces différents mécanismes et processus qui vont permettre le bon déroulement du cycle cellulaire vont être assurés par des mécanismes de surveillance appelés « Checkpoints » qui se mettent en place lorsqu’une étape du cycle cellulaire n’a pas été correctement accomplie. Il est donc évident de s’intéresser aux différents mécanismes de régulation du cycle cellulaire et ce, dans un but thérapeutique.
En présence de dommages à l’ADN, les cellules eucaryotes vont enclencher une voie de signalisation assez conservée dans le but de réparer les différentes lésions de l’ADN. En amont de ces voies de signalisation, on trouve différentes kinases ATR/Mec1, Chk1, Chk2/Rad53 qui vont contribuer à l’arrêt du cycle cellulaire. Dans le modèle S.cerevisiae, l’activation de ces différentes kinases va permettre de bloquer les cellules au stade métaphase-anaphase par une stabilisation de protéines spécifiques telles que Pds1 (Sécurine), et des cyclines mitotiques Clb1-4. Le but du projet est de tenter d’identifier les mécanismes qui seraient responsables d’une telle stabilisation des cyclines mitotiques, plus particulièrement en ciblant la cycline mitotique Clb2, par une combinaison d’approches génétiques, biochimiques et cellulaires. On cherche également à établir si la protéine Clb2 est une cible directe des kinases ATR/Mec1, Chk1 ou Chk2/Rad53.
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Etablissement Français du Sang EFS Marseille
- Master Recherche
2009 - 2009
UMR 6578 « Emergence and co-évolution Virale. Etude sur les Anellovirus, prévalence et détection sur différents supports et suivi d’un patient. Techniques de biologie moléculaires associées à la détection virale. Adaptations protocoles. Techniques SISPA-RCA, clonages, PCR, extraction ADN, séquençage, migrations sur gel agarose, Electrophorèse. (Marseille Hôpital Timone) » Pr. De Micco, Pr. Biagini.
En 1997, un clone de 500 nt (N22) a été isolé par analyse RDA (Representational difference Analysis, soustraction génique) à partir du sérum d’un patient Japonais (initiales T.T) souffrant de troubles cardiaques et présentant une hépatite posttransfusionnelle non A-G. Cette identification a pu être faîte à partir de deux échantillons sanguins prélevés avant et pendant le pic d’ALT. Ce clone N22 a montré une faible homologie avec les autres séquences déposées à cette date dans les banques de données. Par la suite, par extension de séquence en amont et en aval de la région N22, on a pu caractériser une séquence faisant approximativement 3700 pb, suggérant un génome linéaire. En 1999, deux équipes ont montré que le génome était en fait de nature circulaire, avec 3853 nt (TTV-1a) et la présence d’une région riche en GC de 120 nt. Depuis lors, des variants du virus TTV de tailles différentes ont été caractérisés par PCR inversée ou par une approche de type SISPA (sequence independant single primer amplification) : le TTMV Torque teno mini virus et le TTMDV Torque teno midi virus, originellement appelé small-anellovirus. Il sont actuellement regroupés dans le genre Anellovirus. Des séquences hautement divergentes ont aussi été détectées chez divers animaux : chimpanzé, macaque, tupaia, tamarin, porc, de même pour les animaux domestiques tel que le chien et le chat. La prévalence de ces Anellovirus chez des patients avec diverses affections ou chez des sujets sains est supérieure à 90%. Le virus peut être détectable dans de multiples localisations biologiques (sang, salive, tissus, etc…). On s’est rapidement rendu compte qu’il existait une énorme diversité génétique chez ce nouveau genre Anellovirus (200 variants actuellement identifiés), nettement plus élevée que chez les autres groupes de virus à ADN simple brin. De plus, au sein d’un même individu, il est possible de détecter plusieurs souches parfois très divergentes, ce qui rend complexe (clonages) l’étude au cas par cas. A l’heure actuelle, on ne sait pas si ces Anellovirus (ou du moins un variant) sont responsables de pathologies, la biologie de ces virus restant à être éclaircie. On sait seulement qu’il existe un lien entre la charge virale et l’immunité d’un individu lorsque celle-ci est perturbée. A l’inverse, pourrait-on parler d’une « pseudo flore virale » ? Alors, avec quel bénéfice pour l’hôte ?
L’étude porte sur 3 axes et sur différents supports biologiques :
- Caractériser le virus TTV dans des échantillons de plasma et de tissu chez un patient ayant subi une greffe rénale et caractériser les souches à différents moments du suivi clinique par des approches séquences dépendantes (PCR). Caractériser le virus TTV dans un échantillon de salive (sujet sain). Rechercher le virus TTV ou ses variants chez une espèce animale jamais encore étudiée, par des approches de PCR et séquences-indépendantes. L’objectif de l’étude est d’utiliser les différentes techniques appliquées à la détection d’un virus et de ses variants. Avec la RCA, on peut augmenter le pool d’ADN viral en dépit de sa faible charge au départ, grâce à la polymérase phi29, enzyme particulièrement efficace sur un support à ADN circulaire. Dans le cas des prélèvements de sérum, la première technique utilisée permet de détecter le virus TTV grâce à une petite portion non codante du génome viral située en amont de l’ORF2, région assez conservée entre isolats.
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Laboratoire EA Evolution Genome Environnement
- BTS Stage
2003 - 2005
tage BTS (en 2 fois): Techniques de biologie moléculaire, risques chimiques et bonnes pratiques du laboratoire, amplification d’ADN nucléaire et mitochondrial, PCR, Electrophorèse, adaptation de protocole, étude morphologique, établissement d’arbres phylogénétiques. (Marseille Faculté Saint Charles) Salducci MD, Chappaz R, Gilles A.
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Groupe Casino
- Hôtesse de Caisse
Saint-Étienne
2000 - 2010
Conseil clientèle, accueil clients, hôtesse de caisse, organisation secteur caisse, mise en rayon.
